Картування генів за допомогою ДНК-зондів

Методи картування генів, які обговорювалися в попередніх розділах, були засновані на експресії досліджуваних генів у культурах клітин. Гени, які кодують ферменти клітинного метаболізму і гени, які кодують поверхневі антигени, такі, як білки головного комплексу гістосумісності або антигени групи крові, задовольняють цій умові. Гени, які не володіють подібним фенотипічним проявом, не можуть бути картовані лише з використанням описаних методів. Це обмеження вдається перебороти за допомогою методів генної інженерії. При цьому стає можливим картування будь-яких послідовностей ДНК, для яких можна одержати відповідний ДНК-зонд. Ці методи внесли воістину революційний переворот у генетичний аналіз гібридів соматичних кліток.

Перше застосування методів роботи з рекомбінантними ДНК для картування генів людини включало ДНК-гібридизацію в розчині. Таким чином, вдалося картувати гени α- і β-глобінів. Зонди, які представляють собою комплементарні ДНК (кднк) цих генів, були отримані за допомогою зворотної транскрипції очищених α- і β-глобінових матриць. Ці зонди у певних умовах не взаємодіють один з одним або з глобіновими генами миші, але утворять стабільні дуплекси при обжизі з відповідними послідовностями ДНК людини. Глобінові кДНК-зонди використовували для тестування в розчині препаратів ДНК, виділених з різних гібридних клонів. Утворення стабільного дуплекса між кДНК-зондом і ДНК досліджуваного препарату свідчило про присутність людських глобінових генів у геномі відповідної гібридної лінії. Каріологічний аналіз виявлених у такий спосіб гібридних клонів дозволив зробити висновки, що гени β-глобінової родини розташовані в хромосомі 11, а α-глобінові в хромосомі 16.

Для проведення гібридизаційного аналізу в розчині потрібно велика кількість ДНК. Додаткові труднощі пов'язані також з можливістю перехресної гібридизації між гомологічними генами людини і миші. Більшість цих труднощів можуть бути подолані за допомогою блот-гібридизації за Саузерном. На першому етапі відповідний ДНК-зонд мітять радіоактивними ізотопами (такими, як 32Р або 3Н) за допомогою нік-трансляції. Потім з гібридних ліній клітин, які несуть визначені хромосоми людини, виділяють препарати тотальної ДНК. Препарати ДНК обробляють рестрикуючими ендонуклеазами, а отримані фрагменти ДНК розділяють гель-електрофорезом, денатурують і переносять на нітроцелюлозні мембранні фільтри. На фільтрах здійснюється гібридизація з тим або іншими міченими ДНК-зондами. Для більшої ефективності можна розділяти ампліфіковані фрагменти хромосомної ДНК. Для цього використовують їхнє попереднє клонування на фагових векторах.

Після гібридизації фільтри накладають на рентгенівську плівку, на якій після прояву виявляються смуги, які відповідають рестрикційним фрагментам, які містять послідовності ДНК, гомологічні даному зондові . Гени співвідносять з певними хромосомами людини на підставі кореляції між присутністю даної хромосоми в гібридній клітинній лінії і наявністю фрагмента людської ДНК, який гібридизується на радіоавтограмі. Даний метод більш чуттєвий, ніж гібридизація ДНК у розчині і, головне, більш специфічний.

Метод гібридизації по Саузерну, поєднаний з підходами, розробленими для генетичного аналізу соматичних клітин, з успіхом застосовувався не тільки для картування визначених генів, але і для локалізації послідовностей ДНК із невідомими функціям, знайденими в бібліотеках генів людини.


Подібні статті

Флора і рослинність урочища Пагур
Людину оточує справжній зелений океан різноманітних рослин, який є важливою, невід’ємною складовою частиною біосфери Землі. Він відіграє незамінну роль у житті як людини, так і всієї природи. Без перебільшення можна сказати, що без зелених росл ...

Біологічні особливості веслоноса
На сучасному етапі функціонування рибного господарства в Україні постає необхідність виявлення додаткових резервів його розвитку, зокрема, пошуку нетрадиційних підходів у веденні господарства, спрямованих на підвищення ефективності, прибут ...

Головне меню