Об’єкти та методи досліджень

Дослідження проводили на мишах лінії C57BL/6J масою 25-32 г та віком 2,5-3 місяці, які знаходилися на стандартному раціоні віварію. Утримання тварин та маніпуляції з ними проводили згідно з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та наукових цілей» (Страсбург, 1986) та «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001).

Миші дикого типу (C57BL/6J) та нокаути Lrat-/- піддавались частковій гепатектомії (ЧГЕ), яка полягала у резекції 2/3 тканини печінки. ЧГЕ проводили в ранкові години в умовах анестезії за методом Mitchell & Willenbring [25], який полягає у почерговому перев’язуванні та резекції лівої латеральної та медіальної часток печінки

Рівень виживання тварин після проведеної хірургічної процедури складав > 95 % та не відрізнявся в межах дослідних груп. Групу дослідного контролю складали тварини, з якими здійснювали усі процедури подібно до тварин, яким проводили часткову гепатектомію, але не піддавали резекції тканини печінки.

Евтаназію тварин (5-6 тварин на кожну групу) проводили під легким ефірним наркозом на 12, 24, 36, 48, 72 години та 7-му добу (168 годин) після проведення ЧГЕ. Тварин зважували, видаляли регенеровану частину печінки, яку використовували для подальшого аналізу. Сироватку отримували шляхом центрифугування крові при 8000 g протягом 15 хвилин.

Визначення рівня колагену проводили на основі аналізу вмісту гідроксипроліну за методом Bergman & Loxley [26]. Для цього наважку тканини печінки (100 мг) або сироватку крові (100 мкл), отриманої з кожної тварини у відповідний проміжок часу, гомогенізували у буфері для екстракції (0,05 моль/л трис HCl, pH 7,5; 0,15 моль/л NaCl, 10 ммоль/л інгібітор протеїназ ФМСФ) та гідролізували у запаяних ампулах в присутності 6 моль/л НСl протягом 24 год при 105 °С. Отриманий гідролізат нейтралізували і додавали буфер оксидації (хлорамін Т в ацетат/цитратному буфері, рН 6,0) та аналітичного ізопропанолового реактиву (3 частини ДМАБ (2 г. парадиметиламінобензальдегіду в 3 мл 60% хлорної кислоти) та 13 частин ізопропанолу). Проби перемішували та інкубували протягом 25 хв при 60 °С. Після охолодження зразків додавали ізопропанол та визначали оптичну густину при λ = 558 нм. Кількість гідроксипроліну (у мкг на г тканини або на мл сироватки) визначали на основі калібрувального графіку, побудованого з використанням стандартних розчинів гідроксипроліну.

Рис. 2.1.Калібрувальний графік стандартних розчинів гідроксипроліну

Для аналізу фракційного складу колагену тканину печінки гомогенізували у буфері для екстракції, після чого колаген екстрагували шляхом обробки дослідних зразків розчином пепсину (1 мг/мл в 0,5 моль/л оцтовій кислоті) протягом 24 год при 4 °С. Екстрагований колаген аналізували методом електрофорезу у 8% верхньому (концентруючий) та 5% нижньому (розділяючий) поліакриламідному гелі в присутності 10 % ДДС-Na та 4 моль/л сечовини [27]. Електрофорез проводили при 60V, при входженні білків у розділяючий гель підвищували до 80V. Після проведення електрофорезу, гелі зафарбовували барвником кумасі G-250, а незв’язаний барвник відмивали сумішшю розчинів 20 % метанолу та 7 % оцтової кислоти. Отримані забарвлені гелі сканували на приладі Gel Doc 2000 (BioRad) та аналізували з використанням програми Quantity One.

Статистична обробка результатів здійснювалась методами варіаційної статистики, обробки результатів досліджень із застосуванням t-критерія вірогідності різниці Ст'юдента. Різниця вважалась достовірною при коефіцієнті вірогідності Р < 0,05.

Подібні статті

Кісткові риби
Кісткові риби - найбільший клас хребетних тварин, що нараховує близько 20000 видів. Найдавніші представники цього класу походять від хрящових риб в кінці силуру. В даний час 99% класу належать до так званих костистих риб, які вперше з'явил ...

Кровоносна система
Розвиток сільського господарства та загальне зростання антропічного впливу на водне середовище загострило проблему виживання водних тварин і, зокрема, риб, в умовах пестицидного навантаження. Забруднення внутрішніх водойм, в тому числі риб ...