Об’єкти та методи досліджень

Дослідження проводили на мишах лінії C57BL/6J масою 25-32 г та віком 2,5-3 місяці, які знаходилися на стандартному раціоні віварію. Утримання тварин та маніпуляції з ними проводили згідно з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та наукових цілей» (Страсбург, 1986) та «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001).

Миші дикого типу (C57BL/6J) та нокаути Lrat-/- піддавались частковій гепатектомії (ЧГЕ), яка полягала у резекції 2/3 тканини печінки. ЧГЕ проводили в ранкові години в умовах анестезії за методом Mitchell & Willenbring [25], який полягає у почерговому перев’язуванні та резекції лівої латеральної та медіальної часток печінки

Рівень виживання тварин після проведеної хірургічної процедури складав > 95 % та не відрізнявся в межах дослідних груп. Групу дослідного контролю складали тварини, з якими здійснювали усі процедури подібно до тварин, яким проводили часткову гепатектомію, але не піддавали резекції тканини печінки.

Евтаназію тварин (5-6 тварин на кожну групу) проводили під легким ефірним наркозом на 12, 24, 36, 48, 72 години та 7-му добу (168 годин) після проведення ЧГЕ. Тварин зважували, видаляли регенеровану частину печінки, яку використовували для подальшого аналізу. Сироватку отримували шляхом центрифугування крові при 8000 g протягом 15 хвилин.

Визначення рівня колагену проводили на основі аналізу вмісту гідроксипроліну за методом Bergman & Loxley [26]. Для цього наважку тканини печінки (100 мг) або сироватку крові (100 мкл), отриманої з кожної тварини у відповідний проміжок часу, гомогенізували у буфері для екстракції (0,05 моль/л трис HCl, pH 7,5; 0,15 моль/л NaCl, 10 ммоль/л інгібітор протеїназ ФМСФ) та гідролізували у запаяних ампулах в присутності 6 моль/л НСl протягом 24 год при 105 °С. Отриманий гідролізат нейтралізували і додавали буфер оксидації (хлорамін Т в ацетат/цитратному буфері, рН 6,0) та аналітичного ізопропанолового реактиву (3 частини ДМАБ (2 г. парадиметиламінобензальдегіду в 3 мл 60% хлорної кислоти) та 13 частин ізопропанолу). Проби перемішували та інкубували протягом 25 хв при 60 °С. Після охолодження зразків додавали ізопропанол та визначали оптичну густину при λ = 558 нм. Кількість гідроксипроліну (у мкг на г тканини або на мл сироватки) визначали на основі калібрувального графіку, побудованого з використанням стандартних розчинів гідроксипроліну.

Рис. 2.1.Калібрувальний графік стандартних розчинів гідроксипроліну

Для аналізу фракційного складу колагену тканину печінки гомогенізували у буфері для екстракції, після чого колаген екстрагували шляхом обробки дослідних зразків розчином пепсину (1 мг/мл в 0,5 моль/л оцтовій кислоті) протягом 24 год при 4 °С. Екстрагований колаген аналізували методом електрофорезу у 8% верхньому (концентруючий) та 5% нижньому (розділяючий) поліакриламідному гелі в присутності 10 % ДДС-Na та 4 моль/л сечовини [27]. Електрофорез проводили при 60V, при входженні білків у розділяючий гель підвищували до 80V. Після проведення електрофорезу, гелі зафарбовували барвником кумасі G-250, а незв’язаний барвник відмивали сумішшю розчинів 20 % метанолу та 7 % оцтової кислоти. Отримані забарвлені гелі сканували на приладі Gel Doc 2000 (BioRad) та аналізували з використанням програми Quantity One.

Статистична обробка результатів здійснювалась методами варіаційної статистики, обробки результатів досліджень із застосуванням t-критерія вірогідності різниці Ст'юдента. Різниця вважалась достовірною при коефіцієнті вірогідності Р < 0,05.

Подібні статті

Молекулярні механізми кросинговеру
Кросинговер - це явище обміну ділянками гомологічних хромосом після кон’югації у профазі-1 мейозу. Результатом цього процесу є обмін генетичною інформацією між хромосомами. Це є одним з головних чинників еволюції,так як забезпечує комбінат ...

Рукокрилі Чернігова
Ряд рукокрилі (кажани) – великий ряд ссавців, здатних активно літати. Його представники поширені на всіх континентах планети від північної межі лісу до тропіків і пустель Австралії (крім Антарктиди). Живляться переважно комахами, хоча для ...