Метод отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки

Х-вірус картоплі (ХВК) є одним з розповсюджених патогенів картоплі в усіх зонах вирощування культури. На Поліссі України спричинювані ним втрати врожаю становлять в середньому 40,8 % [1]. ХВК превалює у посівах в моноінфекції чи в комплексі з іншими мозаїчними вірусами (64 % обстежених зразків) при ступені ураженості сортозразка 5-100% [2]. Контроль насіннєвого матеріалу показує, що у відкритий грунт висаджується здоровий пробірковий матеріал, який у процесі подальшого розмноження зазнає реінфекції: ураженість клонового матеріалу становить 13-57 % залежно від імунологічних характеристик сорту, досягаючи 100 % на окремих сортах.

При аналізі відібраного в полі матеріалу виявляється латентна інфекція в 20-70 % зразків, що вказує на необхідність використання імунологічних методів діагностики вірусу для отримання об'єктивної інформації щодо якості матеріалу в насінницькій, селекційній роботі, ефективності захисних заходів, при вивченні циркуляції вірусу в природних умовах. Біологічні особливості ХВК дають можливість виявляти його у вегетуючих рослинах методом крапельної аглютинації [3] при чутливості методу 1-100 мкг/мл, а також методом імуноферментного аналізу.

Контроль фітопатогенних вірусів потребує методичного забезпечення. Пошук нових методичних підходів при розробці і виробництві засобів діагностики з урахуванням особливостей патогенів спрямований на створення ефективних діагностикумів фітопатогенних вірусів.У представленій роботі ми ставили за мету розробити метод отримання чистих препаратів ХВК для виробництва діагностичної антисироватки.

ХВК накопичували на рослинах томатів сорту Перемога, які вирощували в умовах вегетаційної камери при 20 °С і фотоперіоді 16 годин. Заражали рослини в фазі 3-4 справжніх листків методом механічної інокуляції з попереднім опудрюванням карборундом. Строк максимальної концентрації вірусу в рослинах томату — 21-25 днів після інокуляції.

При розробці методу очищення використовували відомі методики [5-8] та прилад для препаративного електрофорезу [9,10], сконструйований в нашому інституті.

Контроль етапів отримання чистих препаратів проводили з використанням реакції крапельної аглютинації [3] та електронної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих 2%-ним розчином фосфорно-вольфрамової кислоти, рН 6,0. Досліджували препарати за допомогою елек-троного мікроскопа Tesla-540 при інструментальному збільшенні 22-30 тис.

Спектри поглинання УФ-світла препаратами МВК реєстрували на однопроменевому спектрофотометрі СФ-46.

Для виділення препарату ХВК листя томатів відбирали на 21-25-й день після зараження.

Проводили інфільтрацію в 0,3 М трис-гліциновому буферному розчині, рН 8,3 з додаванням 0,1 %-ного 2-меркаптоетанолу (ME) та 0,01 М ЕДТА протягом 12 годин за температури +4 °С.

Попередня інфільтрація рослинного матеріалу сприяла підвищенню ефективності екстракції вірусу, блокуючи дію ферментів рослинного соку.

Після інфільтрації листя подрібнювали на вальцевому пресі ПВЛ-1 в присутності 0,3 М трис-гліцинового буфера, рН 8,3 у співвідношенні 1:2. Отриманий гомогенат віджимали через капронове сито. Екстракт в трис-гліциновому буферному розчині містив менше пігменту, ніж при використанні фосфатного чи цитратного буферних розчинів, що значно поліпшувало наступні етапи очистки.

Подібні статті

Антигени, їх властивості та будова
Антиген - функціональне поняття. Ним може бути будь-яка речовина, що здатна викликати імунну відповідь. Потужними антигенами є білки. Це зрозуміло, оскільки більшість процесів імунного розпізнання - це білок-білкові взаємодії. Білковими ...

Кісткові риби
Кісткові риби - найбільший клас хребетних тварин, що нараховує близько 20000 видів. Найдавніші представники цього класу походять від хрящових риб в кінці силуру. В даний час 99% класу належать до так званих костистих риб, які вперше з'явил ...